Master 2 GÃ©nÃ©tique et DÃ©veloppement des Plantes
UniversitÃ© Bordeaux 1 / UniversitÃ© Bordeaux 2
AnnÃ©e 2006–2007

Rapport de stage de Master 2
Adaptation du Mildiou de la Vigne
Ã  la Pression Fongicide :
Ã‰tude du Fitness
Ã‰tudiant : Pierre Abadie
Laboratoire d’accueil : Inra Bordeaux-Aquitaine, Umr SantÃ© VÃ©gÃ©tale
Encadrant : Marie-France Corio-Costet (DR)
DurÃ©e : Janvier 2007 – Juin 2007 

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 [R] [C] [L]Rapport de stage [R]2007
Introduction 
Le mildiou (de l’anglais mildew) est le nom gÃ©nÃ©rique d’une sÃ©rie de maladies cryptogamiques des plantes, telles que le mildiou de la Pomme de Terre, des cucurbitacÃ©es ou de la vigne. Les symtÃ´mes classiques du mildiou de la vigne sont la prÃ©sence de "taches d’huile" sur le feuilles, de lÃ©sions brunes sur les feuilles et les tiges, ou encore le pourrissement des baies. L’agent responsable de cette maladie est Plasmopara viticola, un microorganisme appartement Ã  la famille des OomycÃ¨tes, anciennement affifliÃ© aux champignons et aujourd’hui rattachÃ© aux algues brunes.
Il s’agit d’un parasite biotrophe spÃ©cifique Ã  la vigne, et ne pouvant pas survivre sans son hÃ´te. Son cycle biologique est assez simple : un cycle sexuÃ© durant la mauvaise saison, avec la formation d’"oeufs d’hiver" de rÃ©sistance, et des cycles asexuÃ©s au cours du printemps et de l’Ã©tÃ© qui sont responsables de la maladie. Le mycÃ©lium asexuÃ© libÃ¨re des sporanges par voie aÃ©rienne. L’humiditÃ© atmosphÃ©rique entraÃ®ne la libÃ©ration de spores par les sporanges, qui germent sur la plante et pÃ©nÃ¨trent au niveau des stomates pour infecter les tissus.
Les premiÃ¨res descriptions en France de cette maladie provenant des Ã‰tats-Unis datent de 1878, et aujourd’hui le mildiou de la vigne est toujours la cause de graves dÃ©gÃ¢ts dans les vignobles. La lutte chimique est le moyen le plus efficace de combattre ce parasite qui mobilise 78% de l’application de fongicides dans les vignobles franÃ§ais. MÃªme si des molÃ©cules efficaces ont Ã©tÃ© dÃ©veloppÃ©es, des populations rÃ©sistantes de ce pathogÃ¨ne apparaissent rapidement et rÃ©guliÃ¨rement. 
Depuis 1996, la famoxadone a Ã©tÃ© massivement utilisÃ©e dans la lutte contre Plasmopara viticola. Cette molÃ©cule appartient Ã  la famille des fongicides QoI  qui inhibent la respiration mitochondriale en bloquant la chaÃ®ne de transport d’Ã©lectrons au niveau de la membrane interne des mitochondries. Des Ã©tudes prÃ©liminaires ont montrÃ© que le rÃ©sistance de Plasmopara viticola Ã  la famoxadone est gÃ©nÃ©ralement causÃ©e par la mutation ponctuelle G143A (substitution d’une base guanine en adÃ©nine en position 143) dans la sÃ©quence du gÃ¨ne mitochondrial du cytochrome b.
Un dÃ©fi actuel majeur dans la comprÃ©hension des processus de rÃ©sistance aux fongicides ou au molÃ©cules toxiques en gÃ©nÃ©ral est la mesure du fitness des pathogÃ¨nes, c’est-Ã -dire de la valeur sÃ©lective des parasites Ã©tudiÃ©s. Il est intÃ©ressant, aussi bien du point de vue scientifique que du point de vue appliquÃ©, de comprendre et de mesurer l’adaptation de ces organismes Ã  leur milieu et l’Ã©volution de cette adaptation, responsable de l’Ã©mergence et de la propagation des gÃ¨nes de rÃ©sistance aux xÃ©nobiotiques. L’objectif gÃ©nÃ©ral de cette Ã©tude est l’acquisition de donnÃ©es sur la propagation et le maintien des populations de Plasmopara viticola rÃ©sistantes aux fongicides , dans l’optique d’une gestion plus raisonnÃ©e de l’application des xÃ©nobiotiques au vignoble. L’objectif plus spÃ©cifique de mon stage est l’Ã©tude du fitness et de la compÃ©titivitÃ© de souches sensibles et rÃ©sistantes Ã  la famoxadone, afin de rÃ©pondre Ã  la queston suivante :
Existe-t-il un coÃ»t de la rÃ©sistance chez Plamopara viticola, c’est-Ã -dire est-ce que les souches ayant acquis la rÃ©sistance Ã  la famoxadone sont moins compÃ©titives que les souches sensibles en absence de fongicide? 
La dÃ©tection d’un coÃ»t de la rÃ©sistance pourrait entraÃ®ner d’intÃ©ressantes rÃ©percussions sur les modes d’applications des fongicides au vignoble, puisque l’absence de traitement permettrait la disparition des populations rÃ©sistantes.
Des donnÃ©es prÃ©liminaires sur le fitness des souches sensibles et rÃ©sistantes ont Ã©tÃ© collectÃ©es avant mon arrivÃ©e au laboratoire, en mesurant plusieurs paramÃ¨tres (taux de croissance, taux de sporulation, taille des sporanges), et n’ont pas permis de conclure en l’existen ou non d’un coÃ»t de la rÃ©sistance chez Plasmopara viticola.
Les objectifs de mon stages sont chronologiquement les suivants : 
1.	ComplÃ©ter les mesures prÃ©cÃ©dentes sur des souches sensibles et rÃ©sistantes afin d’obtenir des donnÃ©es sur le fitness. 
2.	RÃ©aliser un test biologique de compÃ©titivitÃ© entre des souches sensibles et rÃ©sistantes : l’Ã©volution des proportions de mÃ©langes de souches sera suivie pendant 8 cycles asexuÃ©s, afin de confirmer ou pas les donnÃ©es de fitness obtenues. 
3.	Utiliser les outils molÃ©culaires pour prÃ©ciser les rÃ©sultats du test biologique : la mutation G143A sera utilisÃ©e comme marqueur par PCR quantitative. 
4.	RÃ©aliser un modÃ¨le informatique de l’Ã©volution de populations sensibles et rÃ©sistantes, en fonction des donnÃ©es de fitness obtenues. 

[MatÃ©riel et MÃ©thodes] Globalement, Ã§a sera ce que j’ai mis dans mon rapport en anglais, en plus dÃ©taillÃ©. Les 2 premiÃ¨res sousparties sont ajoutÃ©es.
[Mesures des paramÃ¨tres de fitness] Depuis l’annÃ©e 2006, 37 souches de Plasmopara viticola ont Ã©tÃ© isolÃ©es Ã  partir de diffÃ©rents vignobles franÃ§ais afin de mener cette Ã©tude globlale sur l’adaptabilitÃ© et le fitness du mildiou de la vigne. Les premiÃ¨res manipulation de ce stage ont consistÃ© Ã  terminer la mesure de paramÃ¨tres de fitness pour ces souches, afin de calculer un indice global de fitness, ou FIC (Fitness Index Complex). Les paramÃ¨tres Ã©tudiÃ©s ont Ã©tÃ© les suivants : 
–	capacitÃ© de sporulation = nombre de sporanges produits Ã  partir d’une goutte d’inoculat de 15 ÂµL Ã  4000 sporanges/mL aprÃ¨s 7 jours de croissance. 
–	frÃ©quence d’infection = proportion de zones infectÃ©es sur 45 zones inoculÃ©es aprÃ¨s 7 jours de croissance. 
–	temps de latence = temps nÃ©cessaire pour obtenir 50% de la sporulation maximale. 
–	taille des sporanges. 
–	efficacitÃ© d’infection = taux de zoospores germant dans un stomate par rapport aux zoospores ne germant pas ou germant en dehors d’un stomate. 
–	fitness de Malthus M = croissance de la population =  oÃ¹ N est le nombre de sporanges et t est le temps. 
Le FIC est alors Ã©gal au produit de tous ces paramÃ¨tres. Il est sans unitÃ©, et est relatif entre les souches.
[Test de compÃ©titivitÃ©] [Protocole gÃ©nÃ©ral de repiquage du mildiou] Les isolats de Plasmopara viticola sont cultivÃ©s sur des feuilles dÃ©tachÃ©es, lavÃ©es Ã  l’eau permutÃ©e stÃ©rile, sÃ©chÃ©es entre deux Ã©paisseurs de sopalin et placÃ©es sur des papiers filtres saturÃ©s en eau, dans des boÃ®tes de PÃ©tri, Ã  22Â°C. L’ensemble des expÃ©riences est rÃ©alisÃ© avec des feuilles de vignes de cÃ©page Cabernet-Sauvignon cultivÃ©es en serre depuis 4 semaines.
Afin de repiquer le mildiou, les sporanges sont prÃ©levÃ©s d’une feuille contaminÃ©e Ã  l’aide d’un pinceau stÃ©rile pour rÃ©aliser une suspension dans de l’eau permutÃ©e stÃ©rile. La concentration de cette suspension est ajustÃ©e selon les expÃ©riences, Ã  l’aide d’une cellule de Malassez (gÃ©nÃ©ralement Ã  40000 sporanges/mL). Puis, 24 gouttes de 15ÂµL de cet inoculum sont dÃ©posÃ©es sur une nouvelle feuille. Une nuit d’attente Ã  22Â°C est nÃ©cessaire pour permettre l’ouverture et l’infection des stomates de la feuille par les spores fraÃ®chement libÃ©rÃ©es des sporanges. Enfin, les gouttes sont sÃ©chÃ©es avec une pompe Ã  vide, et les boÃ®tes sont scellÃ©es pour maintenir une humiditÃ© constante. AprÃ¨s une semaine Ã  22Â°C, la sporulation du mildiou peut Ãªtre observÃ©e (figure 1).

Fig. 1:  Repiquage in vitro du mildiou de la vigne.
[Protocole du test de compÃ©titivitÃ©] L’objectif du test de compÃ©titivitÃ© est de suivre l’Ã©volution des proportions de mÃ©langes de souches sensibles et rÃ©sistantes au cours de plusieurs cycles asexuÃ©s.
Pour chaque couple de souches sensible/rÃ©sistante, 3 suspensions de sporanges initiales Ã  40000 sporanges/mL sont prÃ©parÃ©es, Ã  20% de rÃ©sistant, 50% de rÃ©sistant, et 80% de rÃ©sistant. Chaque suspension est inoculÃ©e sur 4 feuilles indÃ©pendantes. AprÃ¨s une semaine de croissance, les sporanges obtenus Ã  partir des 4 feuilles sont rÃ©inoculÃ©s sur 4 nouvelles feuilles. Ces repiquages sont rÃ©pÃ©tÃ©s durant 8 cycles asexuÃ©s, soit 8 semaines d’expÃ©rience.
Ã chaque cycle, des Ã©chantillons des mÃ©langes de sporanges sont prÃ©levÃ©s pour rÃ©aliser un crible fongicide et une mesure par PCR quantitative (voir par la suite) afin d’estimer les nouvelles proportions de souches rÃ©sistantes et sensibles au cours des cycles reproductifs. La figure 2 illustre le schÃ©ma gÃ©nÃ©ral du test de compÃ©titivitÃ© mis en place. 

Fig. 2:  SchÃ©ma global du test de compÃ©titivitÃ© rÃ©alisÃ© dans cette Ã©tude.
L’ensemble du test de compÃ©titivitÃ© est rÃ©pÃ©tÃ© indÃ©pendemment deux fois par semaine.
[Crible fongicide] L’objectif du crible fongicide est d’estimer le pourcentage de rÃ©sistant d’une suspension de sporanges, en faisant pousser le champignon en prÃ©sence de fongicide.
En mÃªme temps que les feuilles sont inoculÃ©es avec les suspensions de rÃ©sistant/sensible pour le test de compÃ©titivitÃ©, une partie de cette suspension est utilisÃ©e pour inoculer des disques de feuilles traitÃ©es au fongicide : pour chaque proportion initiale de chaque couple, deux boites de PÃ©tri contenant 8 disques de feuilles sont prÃ©parÃ©es. Les disques sont sprayÃ©s avec de la famoxadone Ã  100mg/mL, et sont sÃ©chÃ©s sous un ventilateur aprÃ¨s une nuit de pÃ©nÃ©tration du fongicide. 3 gouttes de 15ÂµL d’inoculum sont dÃ©posÃ©es sur chaque disque, conservÃ©es Ã  l’obscuritÃ© Ã  22Â°C pendant la nuit, puis sÃ©chÃ©es Ã  la pompe Ã  vide.

Fig. 3:  Croissance des taches sporulantes de mildiou sur disques de feuilles traitÃ©s Ã  la famoxadone.
AprÃ¨s une semaine de croissance Ã  22Â°C, les taches de sporulation correspondant Ã  la croissance de la souche rÃ©sistante sont observÃ©es (figure 3). Ã l’aide d’une Ã©chelle visuelle (figure 4), on attribue une note Ã  chaque tache, ce qui permet d’estimer la proportion de la souche rÃ©sistante dans le mÃ©lange inoculÃ© initialement.

Fig. 4:  Ã‰chelle de notation visuelle.
[PCR Quantitative] ParallÃ¨lement au crible fongicide, une mÃ©thode de quantification de la proportion de souches rÃ©sistante/sensible basÃ©e sur la dÃ©tection de la mutation G143A dans le gÃ¨ne mitochondrial codant pour la protÃ©ine du cytochrome b est mise en place.
[Extraction d’ADN] Une partie des suspensions de sporanges utilisÃ©es pour les repiquages du test de compÃ©titivitÃ© et pour le crible fongicide est prÃ©levÃ©e pour la PCR quantitative. Pour chaque proportion de chaque couple de souches, 2 tubes de 0,5mL de suspension de sporanges et 4 disques de feuilles contenant chacun 3 taches sporulantes sont prÃ©parÃ©s Ã  chaque cycle, et conservÃ©s Ã  -20Â°C pour en extraire l’ADN total, selon le protocole suivant : 
–	Les Ã©chantillons sont centrifugÃ©s 10min 1300rpm, le culot est refroidi Ã  -80Â°C et lyophylisÃ© sous vide Ã  -55Â°C durant une nuit. 
–	Le culot ainsi dÃ©shydratÃ© est broyÃ© Ã  l’aide d’un pilon, puis 600ÂµL de solution de CTAB  (Cetyl TrimethylAmmonium Bromide) Ã  65Â°C sont ajoutÃ©s. 
–	AprÃ¨s 1h d’incubation, 400ÂµL de chloroforme-isoamylalcool sont ajoutÃ©s, et les tubes sont agitÃ©s lentement pendant 10min. Puis, les tubes sont centrifugÃ©s 10min Ã  13000rpm, et on conserve la phase aqueuse. 
–	2/3 de volume d’isopropanol froid (-20Â°C) sont ajoutÃ©s, le mÃ©lange est secouÃ© doucement pendant 10min, et l’ADN est laissÃ© Ã  prÃ©cipiter pendant au moins 2h Ã  -20Â°C. 
–	Les tubes sont centrifugÃ©s 10min Ã  4Â°C et 13000rpm, le culot est rincÃ© avec 800ÂµL d’Ã©thanol Ã  -20Â°C, et centrifugÃ© de nouveau 10min Ã  13000rpm. 
–	Enfin, le culot est sÃ©chÃ© 15 minutes au speed-vac, resuspendu dans 50ÂµL d’eau milliQ stÃ©rile et conservÃ© Ã  -20Â°C. 
[Amplification et quantification de l’ADN] Dans le but de mesurer les proportions de rÃ©sistant/sensible dans les mÃ©langes, une stratÃ©gie basÃ©e sur la dÃ©tection de la mutation G143A (qui confÃ¨re la rÃ©sistance Ã  la famoxadone) a Ã©tÃ© mise en place, basÃ©e sur l’utilisation de 2 couples d’amorces en PCR quantitative : 
–	Un premier couple spÃ©cifique Ã  Plasmopara viticola, ne discriminant pas l’allÃ¨le rÃ©sistant ou sensible, qui conduit Ã  l’amplification du gÃ¨ne d’une portion du gÃ¨ne du cytochrome b. 
–	Un deuxiÃ¨me couple conduisant aussi Ã  l’amplification du gÃ¨ne du cytochrome b, mais pour lequel une des deux amorces s’hybride directement avec la mutation G143A, et qui est donc par consÃ©quent spÃ©cifique Ã  l’allÃ¨le rÃ©sistant. 
La figure 5 illustre la faÃ§on dont s’hybrident les deux couples d’amorces.

Fig. 5:  Hybridation des deux couples d’amorces utilisÃ©es en PCR quantitative
Ainsi, en rÃ©alisant une PCR quantitative avec les deux couples d’amorces pour chaque Ã©chantillon, il est possible d’effectuer le rapport entre l’ADN amplifiÃ© par le couple d’amorce spÃ©cifique et celui amplifiÃ© par le couple non spÃ©cifique au rÃ©sistant, ce qui nous permet d’obtenir la proportion de rÃ©sistant dans le mÃ©lange considÃ©rÃ©.
Le protocole suivant est utilisÃ© pour l’amplification : 5ÂµL de Master Mix SybrGreen , 0,1ÂµL de chaque amorce Ã  XÂµM/ÂµL, et 2,5ÂµL d’ADN extrait prÃ©cÃ©demment complÃ©tÃ©s Ã  10ÂµL avec de l’eau milliQ sont soumis Ã  30 cycles de PCR.
[RÃ©sultats Obtenus]
[Fitness des souches Ã©tudiÃ©es] La majoritÃ© des rÃ©sultats de fitness suivants ont Ã©tÃ© obtenus au cours de l’annÃ©e derniÃ¨re, et le dÃ©but de mon stage a consistÃ© Ã  terminer ces mesures, qui sont la base de la suite des expÃ©riences. Je ne dÃ©taillerai donc pas l’ensemble des rÃ©sultats obtenus, mais simplement la synthÃ¨se de toutes les expÃ©rimentations. Le diagramme de la figure 6 montre l’indice de fitness obtenu pour l’ensemble des souches Ã©tudiÃ©es.

Fig. 6:  FIC (fitness index complex) obtenu pour les 34 souches Ã©tudiÃ©es (flÃ¨ches rouges : souches sÃ©lectionnÃ©es pour le test de compÃ©titivitÃ©).
Ces rÃ©sultats montrent qu’il existe une variabilitÃ© au niveau du fitness de ces souches provenant de divers vignobles franÃ§ais. Toutefois, la valeur moyenne de FIC est de 0,22±0,09 pour les souches sensibles Ã  la famoxadone, et 0,27±0,09 pour les souches rÃ©sistantes. Ces valeurs ne sont pas significativement diffÃ©rentes (P=0,17). Ainsi mÃªme si pour certains paramÃ¨tres Ã©tudiÃ©s, comme l’indice de Malthus, il existait des diffÃ©rences entre les souches sensibles et rÃ©sistantes, il semble donc que l’on ne puisse pas dÃ©tecter de coÃ»t de la rÃ©sistance chez Plasmopara viticola.
Toutefois, ces donnÃ©es servent de base Ã  la mise en place du test de compÃ©titivitÃ©, qui vise Ã  confirmer ou infirmer les donnÃ©es de fitness. Pour cela, des couples de souches rÃ©sistante et sensible sont formÃ©s : Les souches utilisÃ©es sont indiquÃ©es par une flÃ¨che rouge sur la figure 6, et les couples du test de compÃ©titivitÃ© sont dÃ©taillÃ©s dans le tableau 1.

Souche	Origine	AnnÃ©e	FIC	PhÃ©notype	
COU15	Petit Couhins (33)	2003	0,366	S	
MIC128	Castillon (32)	2005	0,329	R	
PIC59	Couhins (33)	2003	0,201	R	
FEM03	Puligny-Montrachet (21)	2003	0,233	S	
PAU32	Pauillac (33)	2003	0,137	R	
COU15	Petit Couhins (33)	2003	0,366	S	
PAU32	Pauillac (33)	2003	0,137	R	
MIC103	Fleurie (69)	2004	0,315	S	
 
Tab. 1:  CaractÃ©ristiques des couples de souches utilisÃ©es lors du test de compÃ©titivitÃ© (S=sensible Ã  la famoxadone, R=rÃ©sistante).
Ces couples ont Ã©tÃ© choisis en fonction de leur FIC et de la disponibilitÃ© en matÃ©riel biologique. Pour les couples COU15/MIC128 et PIC59/FEM03, les FIC des deux souches sont Ã©quivalents. Pour les couples PAU32/COU15 et PAU32/MIC103, la souche rÃ©sistante a un mauvais fitness par rapport Ã  la sensible, on s’attend donc Ã  ce qu’elle soit moins compÃ©titive.
[Test de compÃ©titivitÃ© : mesures biologiques] [Standardisation des mesures] Dans le but de dÃ©terminer l’Ã©volution des proportions des souches sensibles et rÃ©sistantes au cours du temps, il faut tout d’abord s’assurer de l’exactitude de la mÃ©thode de notation visuelle utilisÃ©e dans le crible fongicide.
Pour cela, une gamme Ã©talon est rÃ©alisÃ©e en inoculant des proportions connues de souches rÃ©sistantes (0 Ã  100%) dans les conditions du crible fongicide (3 gouttes par disque traitÃ© Ã  la famoxadone). AprÃ¨s une semaine de culture, les taches sporulantes sont notÃ©es de 0 Ã  5 en utilisant l’Ã©chelle de notation visuelle (figure 4). Les rÃ©sultats des inoculations Ã  40000 sporanges/mL sont prÃ©sentÃ©s figure 7.

Fig. 7:  Gammes Ã©talon de la notation visuelle du crible fongicide pour les quatre couples Ã©tudiÃ©s. Abcisse : pourcentage de souche rÃ©sistante (connu) ; OrdonnÃ©e : note visuelle ; Erreur : SEM = standart error mean ; PointillÃ©s : rÃ©gression linÃ©aire et coordonnÃ©es correspondantes.
Comme nous pouvons le voir sur la figure 7, il existe un bonne corrÃ©lation entre le pourcentage de souche rÃ©sistante et la note visuelle correspondante aprÃ¨s une semaine de croissance sur fongicide. De plus, un inoculum de concentration Ã©gale Ã  40000 sporanges/mL Ã©tends la notation visuelle de 0 Ã  5 de faÃ§on linÃ©aire. Cette concentration nous permet donc d’avoir une bonne prÃ©cision de notation, et sera utilisÃ©e pour la suite de l’Ã©tude.
[RÃ©sultats expÃ©rimentaux] La figure 8 prÃ©sente les rÃ©sultats obtenus lors des 2 tests biologiques de compÃ©titivitÃ©s qui ont Ã©tÃ© rÃ©alisÃ©s.

Fig. 8:  Test biologique de compÃ©titivitÃ© : Ã©volution du pourcentage de souche rÃ©sistante dans les mÃ©langes pour chaque couple au cours des deux rÃ©pÃ©titions (Ã  gauche : 1er test ; Ã  droite : 2Ã¨me test ; en bleu : mÃ©lange initial 20% de rÃ©sistant : en rouge : 50% ; en vert : 80% ; barres d’erreur : SEM = standart error mean ; nombre de mesures par point : 42)
Le premier point que l’on peut remarquer sur ces courbes est la faible taille des barres d’erreur pour chaque point : au cours des 2 tests de 8 semaines (8 cycles), les souches ont poussÃ© de faÃ§on homogÃ¨ne entre les diffÃ©rentes boites, ce qui est un Ã©lÃ©ment positif dans la rÃ©alisation dÃ©licate de ces tests biologiques qui sont trÃ¨s dÃ©pendants des conditions environnementales. Cependant, on constate qu’il existe des diffÃ©rences d’Ã©volution entre le test 1 et le test 2, qui ont Ã©tÃ© rÃ©alisÃ©s indÃ©pendamment dans le temps.
Pour le couple COU15/MIC128, il est difficile de dÃ©gager une tendance vers l’augmentation ou la diminution des proportions de la souche rÃ©sistante au cours du temps. Pour les couples PAU32/COU15 et PIC59/FEM03, on assiste Ã  une diminution de la souche rÃ©sistante dans le test 2, qui n’est apparemment pas observÃ©e dans le test 1. Enfin pour le couple PAU32/MIC103, la souche rÃ©sistante semble augmenter dans le test 1, et chuter dans le test 2. 
Cependant, ces donnÃ©es brutes ne doivent et ne peuvent pas Ãªtre anlysÃ©es telles quelles : un travail statistique est nÃ©cessaire afin de dÃ©terminer avec certitude et prÃ©cision les tendances d’Ã©volution de l’ensemble de ces rÃ©sultats.
[Analyse statistique] Leonard a proposÃ© en 1959 une mÃ©thode mathÃ©matique de reprÃ©sentation et d’analyse de l’Ã©volution de proportions de souches de Puccinia graminis en mÃ©lange. Elle est basÃ©e sur la rÃ©flexion suivante :
Si on considÃ¨re un mÃ©lange de 2 souches de fitness diffÃ©rent, s Ã©tant le rapport entre ces 2 fitness (s=cst), et  le nombre d’individus de chaque souche Ã  la gÃ©nÃ©ration n, on peut Ã©crire que . Soient  et  les proportions de chaque souche (p=1-q), on peut en dÃ©duire par un rapide calcul que , puis que . En remplaÃ§ant dans cette Ã©quation p par 1-q et aprÃ¨s quelques manipulations, on aboutit alors Ã  l’Ã©quation suivante, 
	
qui est de la forme y=ax+b.
Ainsi, en reprÃ©sentant sur un diagramme  en fonction du nombre de cycles, le rÃ©sultat thÃ©orique est une droite de pente Ã©gale Ã  . Si cette pente est positive, cela veut donc dire que s est infÃ©rieur Ã  1, et donc que la souche rÃ©sistante a un meilleur fitness que la souche sensible. 
La figure 9 rassemble les diagrammes de  en fonction du temps pour chaque couple. Sur chaque diagramme, est reprÃ©sentÃ©e la rÃ©gression linÃ©aire des points obtenus pour les 3 mÃ©langes initiaux et les 2 tests indÃ©pendants. Le code de couleur est expliquÃ© dans la lÃ©gende.

Fig. 9:  ReprÃ©sentation de  en fonction du nombre de cycle pour chaque couple et chaque test (une rÃ©gression linÃ©aire est effectuÃ©e pour chaque sÃ©rie de donnÃ©es).
L’observation des rÃ©sultats de la figure 9 nous permet d’affirmer pour chaque test s’il y a une augmentation ou une diminution de la proportion de souche rÃ©sistante, en fonction de la pente de la droite de rÃ©gression. De plus, un test t de Student unilatÃ©ral est rÃ©alisÃ© Ã  partir des deux valeurs de pente pour chaque couple et chaque mÃ©lange, afin d’affirmer ou de rejeter l’hypothÃ¨se selon laquelle la proportion augmente ou diminue.
Par la suite, la moyenne des rÃ©sultats des tests 1 et 2 (figure 8) est rÃ©alisÃ©e, et accompagnÃ©e des rÃ©sultats des calculs de significativitÃ© d’Ã©volution des proportions. L’ensemble de ces rÃ©sultats est synthÃ©tisÃ© en figure 10. 

Fig. 10:  Ã‰volution moyenne des proportions de souches rÃ©sistantes sur l’ensemble des deux tests (erreur : SEM = standart error mean ; Ã©toile rouge : test t de Student significatif avec a=0,05%).
Les Ã©volutions de proportions visibles sur les courbes de la figure 10 sont significatives (test t de Student avec risque a de 0,05%, Ã©toiles rouges sur les graphiques) pour tous les couples sauf PAU32/MIC103. 
–	Couple COU15/MIC128 : ces deux souches ont un FIC Ã©quivalent (COU15 : 0,366 ; MIC128 : 0,329). On constate que leurs proportions ne varient pas au cours des 8 cycles, ce qui est cohÃ©rent avec les donnÃ©es de fitness. 
–	Couple PAU32/COU15 : la souche rÃ©sistante PAU32 a un FIC plus faible que COU15 (0,137 contre 0,366). La proportion de PAU32 diminue au cours des 8 cycles, il semble donc que le fitness et la compÃ©titivitÃ© soient liÃ©s, ce qui est cohÃ©rent. 
–	Couple PIC59/FEM03 : ces deux souches ont un FIC Ã©quivalent (0,201 et 0,233). MÃªme si on observe un chute de la souche rÃ©sistante en fin d’expÃ©rience, les proportions ne varient quasiment pas avant 6 cycles. 
–	Couple PAU32/COU15 : la souche rÃ©sistante PAU32 a un FIC plus faible que MIC103 (0,137 contre 0,315). Il s’agit du seul couple pour lequel les Ã©volutions obtenues ne sont pas statistiquement significatives. Ceci s’explique par le fait que la proportion de souche rÃ©sistante PAU32 tend Ã  augmenter dans le test 1, et Ã  diminuer dans le test 2 (voir figure 8). 
Afin de pouvoir rÃ©ellement conclure sur les Ã©volutions de toutes ces souches, il est nÃ©cessaire d’analyser les rÃ©sultats des mesures de PCR quantitatives. En effet, ces mesures sont basÃ©es sur les mÃªmes tests biologiques de compÃ©titivitÃ©, mais utilisent des outils molÃ©culaires pour quantifier les proportions de souches.
[Test de compÃ©titivitÃ© : mesures molÃ©culaires]
[Standardisation des mesures] De la mÃªme faÃ§on que pour les mesures biologiques (voir partie 2.2.1), des gammes de concentrations de sporanges sont rÃ©alisÃ©es pour tous les couples. L’ADN est extrait Ã  partir de ces solutions d’inoculum, et la PCRQ est rÃ©alisÃ©e Ã  partir de ces Ã©chantillons (voir partie 1.4.2). Les rÃ©sultats, non montrÃ©s ici, montrent une relation linÃ©aire entre la proportion de souche rÃ©sistante dans le mÃ©lange Ã  analyser, et la proportion d’ADN de la souche rÃ©sistante obtenue avec la PCR. Ainsi, un rapide calcul nous permet pour chaque couple de dÃ©terminer la proportion de souche rÃ©sistante dans le mÃ©lange Ã  analyser, Ã  partir des rÃ©sultats de PCRQ. [RÃ©sultats] Les courbes prÃ©sentÃ©es par la suite sont les moyennes de 4 mesures indÃ©pendantes par PCRQ. L’Ã©volution de  est aussi prÃ©sentÃ©e, pour permettre de voir clairement si les proportions augmentent ou diminue au cours du temps.

Fig. 11:  Mesure par PCR quantitative de l’Ã©volution de la proportion de la souches rÃ©sistante MIC128, Ã  partir des trois mÃ©langes initiaux (20%, 50%, 80%) (courbe de gauche : Ã©volution de %R ; courbe de droite : Ã©volution de  ; barres d’erreur : SEM = standart error mean)
Pour le couple COU15/MIC128 (figure 11), il est difficile de dÃ©gager une Ã©volution Ã  partir des rÃ©sultats bruts. En revanche, l’observation de l’Ã©volution de  montre qu’on n’a pas de rÃ©elle augmentation ou diminution de la proportion de souche rÃ©sistante. Ces rÃ©sultats confirment donc les rÃ©sultats obtenus par les mesures biologiques (figure 10).

Fig. 12:  Mesure par PCR quantitative de l’Ã©volution des proportion de la souche rÃ©sistante pour les deux couples PAU32/COU15 et PAU32/MIC103, Ã  partir des trois mÃ©langes initiaux (20%, 50%, 80%) (courbe de gauche : Ã©volution de %R ; courbe de droite : Ã©volution de  ; barres d’erreur : SEM = standart error mean)
Pour le couple PAU32/COU15 (figure 12), on obtient des rÃ©sultats Ã©quivalents aux rÃ©sultats des mesures biologiques de la figure 10, avec la diminution de la souches PAU32. Pour le couple PAU32/MIC103, on observe aussi la diminution de la souche PAU32, qui n’Ã©tait pas significativement observable lors des mesures biologiques.

Fig. 13:  Mesure par PCR quantitative de l’Ã©volution de la proportion de la souches rÃ©sistante PIC59, Ã  partir des trois mÃ©langes initiaux (20%, 50%, 80%) (courbe de gauche : Ã©volution de %R ; courbe de droite : Ã©volution de  ; barres d’erreur : SEM = standart error mean)
Pour le couple PIC59/FEM03 (figure 13), on constate cette fois une augmentation marquÃ©e de la souche rÃ©sistante PIC59, alors que les mesures biologiques (figure 10) ne montraient pas d’augmentation, et prÃ©sentaient mÃªme une diminution Ã  partir du cycle 6.
[ModÃ¨le d’Ã©volution]
[Discussion]
[Rappel des objectifs de l’Ã©tude] Cette Ã©tude s’insÃ¨re dans un projet visant Ã  acquÃ©rir des donnÃ©es sur l’apparition, le maintien et la dispersion de la rÃ©sistance Ã  des fongicides chez Plasmopara viticola. Les objectifs Ã©taient dans un premier temps, de dÃ©terminer un indicateur du fitness, appelÃ© FIC, d’un grand nombre de souches franÃ§aises, afin de voir si l’acquisition de la rÃ©sistance Ã  un fongicide s’accompagne d’un handicap Ã©volutif, d’un coÃ»t de la rÃ©sistance, ce qui permettrait la mise en place de nouvelles stratÃ©gies de lutte contre ce parasite. AprÃ¨s avoir mesurÃ© ces valeurs de FIC, il Ã©tait nÃ©cessaire dans un deuxiÃ¨me temps de valider ces rÃ©sultats en mettant en place un test de compÃ©titivitÃ©, dont les rÃ©sultats confirmeraient ou au contraire rejetteraient cette mÃ©thode de mesure du fitness chez un champignon.
[Analyse des rÃ©sultats du test biologique de compÃ©titivitÃ©] Cette expÃ©rience se base sur un protocole dÃ©licat, en raison des nombreux paramÃ¨tres difficiles Ã  contrÃ´ler au cours de ce test biologique. En effet, la mise en interaction de deux Ãªtres vivants (ici le mildiou et la vigne) pour la rÃ©alisation d’une expÃ©rience peut s’avÃ©rer hasardeuse en raison des rÃ©actions possibles, indÃ©tectables, ou inconnues qui peuvent avoir lieu. Des variations mÃªmes minimes de l’environnement (tempÃ©rature, luminositÃ©, humiditÃ©) peuvent aussi entraÃ®ner des biais dans les observations. De plus, l’Ã©talement du test sur 8 semaines nÃ©cessite une grande vigilance vis-Ã -vis des contaminations possibles par des hyperparasites, ou du maintien en vie des souches Ã©tudiÃ©es.
Toutefois, les rÃ©sultats du test s’avÃ¨rent concluants : les souches ont Ã©tÃ© conservÃ©es sans contamination, et les observations mesurÃ©es ne prÃ©sentent pas d’aberrations. La rÃ©alisation d’un grand nombre de rÃ©pÃ©titions et de contrÃ´les permet d’obtenir des donnÃ©es statistiquement solides. En effet, chaque point reprÃ©sentÃ© sur la figure 10 est le rÃ©sultat de 88 mesures, et est associÃ© Ã  un faible Ã©cart-type.
Si on regarde les rÃ©sultats pour chaque couple (figure 10), l’Ã©volution des proportions des souches rÃ©sistantes est en accord avec les donnÃ©es de fitness (tableau 1) pour les couples COU15/MIC128 et PAU32/COU15. Les rÃ©sultats du couple PAU32/MIC103 ne sont pas exploitables en raison de l’Ã©volution diffÃ©rente observÃ©e entre le test 1 et le test 2 (figures 8 et 9). Le couple PIC59/FEM03 prÃ©sente une trÃ¨s lÃ©gÃ¨re diminution, concordante avec les donnÃ©es de fitness. Ces donnÃ©es biologiques doivent Ãªtre complÃ©tÃ©es par les mesures molÃ©culaires.
[Analyse des rÃ©sultats de PCR quantitative] Dans cette Ã©tude, 2 mÃ©thodes diffÃ©rentes sont utilisÃ©es pour mesurer la proportion de souche rÃ©sistante et sensible, Ã  partir des mÃªmes Ã©chantillons issus des tests biologiques. La premiÃ¨re mÃ©thode consiste Ã  cribler le mÃ©lange en le cultivant en prÃ©sence de fongicide pendant une semaine, et Ã  attribuer une note visuelle Ã  la sporulation observÃ©e pour dÃ©duire la proportion initiale. La seconde se base sur la mutation G143A confÃ©rant la rÃ©sistance au fongicide, et quantifie la proportion de cet allÃ¨le par rapport Ã  l’ADN total extrait Ã  partir du mÃ©lange initial. 
Les avantages de la mÃ©thode molÃ©culaire sont multiples : elle est beaucoup plus rapide, plus prÃ©cise et en thÃ©orie plus reproductible, mais coÃ»te plus cher. Si on compare les rÃ©sultats obtenus via cette mÃ©thode (figures 11, 12 et 13), on constate qu’ils sont similaires et confirment les rÃ©sultats du crible fongicide pour les couples COU15/MIC128 et PAU32/COU15. Pour le couple PAU32/MIC103, la diminution de PAU32 est ici confirmÃ©e, alors qu’elle n’Ã©tait pas significative avec la mesure biologique seule. En revanche, les rÃ©sultats sont plus problÃ©matique pour le couple PIC59/FEM03 : ce couple prÃ©sente une diminution de PIC59 faible mais significative en mesure biologique (figure 10), et prÃ©sente une augmentation trÃ¨s nette et rapide de PIC59 en mesure molÃ©culaire (figure 13). Bien que l’on s’attende Ã  une diminution de PIC59 si on regarde les valeurs de FIC correspondantes, l’augmentation dÃ©tectÃ©e par PCR quantitative ne peut Ãªtre ignorÃ©e, sachant que la diminution observÃ©e en mesure biologique est trÃ¨s faible. Nous avons donc ici un exemple oÃ¹ la souche prÃ©sentant le plus mauvais fitness semble la plus compÃ©titive.
[Existe-t-il un coÃ»t de la rÃ©sistance chez le mildiou de la vigne? ]
En dehors des rÃ©sultats du couple PIC59/FEM03, les rÃ©sultats du test de compÃ©titivitÃ© confirment les donnÃ©es de fitness obtenues prÃ©cÃ©demment (tableau 1). Il est donc possible d’analyser les donnÃ©es de la figure 6 pour conclure Ã  l’existence ou non d’un coÃ»t de la rÃ©sistance chez Plasmopara viticola. 
Comme nous l’avons vu, les valeurs moyennes de FIC entre les souches sensibles et rÃ©sistantes ne sont pas statistiquement diffÃ©rentes, exceptÃ© pour la mesure de l’indice de Malthus (donnÃ©es non prÃ©sentÃ©es). Or, certains auteurs (pringle...) considÃ¨rent que les phases asexuÃ©es des champignons sont comparables au type de reproduction bactÃ©rien, et la mesure de l’indice de Malthus serait donc le meilleur moyen de dÃ©terminer le fitness des champignons. Toutefois, les rÃ©sultats du test de compÃ©titivitÃ© qui sont concordants avec les valeurs de FIC tendent Ã  montrer que la prise en compte des multiples paramÃ¨tres (infectiositÃ©, taille des sporanges, taux de sporulation, frÃ©quence d’infection, ¼) permet d’apprÃ©hender de maniÃ¨re plus prÃ©cise la compÃ©titivitÃ©, donc le fitness des champignons. Au vu des rÃ©sultats disponibles, nous ne pouvons donc pas conclure Ã  l’existence d’un coÃ»t de la rÃ©sistance.
Si quelques Ã©tudes ont pu dÃ©montrer in vitro l’existence de coÃ»ts de la rÃ©sistance chez les champignons en utilisant des mutants artificiels et des lignÃ©es isogÃ©niques, l’Ã©tude de souches prÃ©levÃ©es in natura se rÃ©vÃ¨le beaucoup plus complexe, en raison du nombre et de la diversitÃ© des forces Ã©volutives qui s’exercent au vignoble. 
Comment peut-on expliquer la non-dÃ©tection du coÃ»t?  L’hypothÃ¨se la plus simple est que le coÃ»t de la rÃ©sistance n’existe pas. En effet, une Ã©tude a montrÃ© que la mutation G143A dans le gÃ¨ne du cytochrome b ne semblait pas avoir de consÃ©quence sur l’efficacitÃ© de la respiration mitochondriale, le fitness des souches rÃ©sistantes ne serait alors pas modifiÃ©. L’autre hypothÃ¨se est que le coÃ»t existe, bien qu’il ne soit pas dÃ©tectÃ© : les seules souches rÃ©sistantes sÃ©lectionnÃ©es au vignoble seraient des souches possÃ©dant initialement un trÃ¨s bon fitness, et l’apparition d’un coÃ»t de la rÃ©sistance ne conduirait donc pas Ã  leur Ã©limination. Une deuxiÃ¨me explication est possible : une Ã©tude d’Ã©volution in vitro a pu montrer qu’un coÃ»t apparaissait en mÃªme temps que la rÃ©sistance, mais que de nouvelles mutations pouvaient rapidement apparaitre et rÃ©tablissaient la valeur du fitness des souches rÃ©sistantes au niveau des souches sensibles. La sÃ©lection naturelle pourrait donc rapidement faire disparaitre un coÃ»t de la rÃ©sistance grÃ¢ce Ã  de nouvelles mutations. 
[Conclusions et Perspectives] conclure en un petit paragraphe